Premessa del Dr. Martini

Studio di efficacia e tossicità di preparazioni di argento colloidale prodotto di Santé Naturels® eseguito presso l’UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II Scuola Politecnica e delle Scienze di Base Dipartimento di Biologia, con valutazione degli effetti sia su cellule procariotiche che eucariotiche mediante saggi in vitro.

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L’attività antibatterica dell’Argento Colloidale Santé Naturels è stata valutata con saggi di attività antibatterica su piastra ed in liquido su ceppi batterici e fungini quali: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.

Il ceppo fungino è Candida Albicans. I risultati di questi saggi dimostrano che l’argento colloidale esercita un effetto antibatterico / antifungino rilevante confrontandolo con un antibiotico tradizionale utilizzato come controllo positivo.

Sono state valutate l’eventuale tossicità dell’argento colloidale su diversi tipi di cellule umane in coltura quali le HaCat (linea di cheratinociti umani); HeLa (linea di adenocarcinoma della cervice uterina); Caco-2 (Linea di adenocarcinoma di colon); HDF (Human Dermal Fibroblast) attraverso il saggio MTT, un test di vitalità cellulare.

Il trattamento con argento colloidale di Santé Naturels,  non determina alcun effetto tossico (al contrario in alcuni esperimenti ha aumentato la vitalità delle cellule). Al contrario, l’argento ionico, utilizzato come controllo positivo, esercita un notevole effetto sulla vitalità, determinando una drastica diminuzione della vitalità delle cellule anche a basse concentrazioni, quindi l'argento ionico presenta un grado di tossicità.

Possiamo concludere che questo studio effettuato dall’Università Federico II di Napoli ha dimostrato che l’argento colloidale di Santé Naturels ha ottime proprietà antibatteriche ed antifungine ed è possibile considerare che questa sostanza risulta  atossica nelle concentrazioni poste in commercio.

L’argento colloidale della Santé Naturels ha dimostrato importanti capacità cicatrizzanti per il tessuto epiteliale

Dr. Domenico Martini

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RELAZIONE SCIENTIFICA ANALISI SU

ARGENTO COLLOIDALE

SANTÉ NATURELS®

INTRODUZIONE

L’uso dell’argento nella pratica clinica e nella cura delle infezioni risale a tempi antichissimi. All’inizio del ventesimo secolo i chirurghi impiegavano punti d’argento di routine per le suture in modo da ridurre il rischio di infezioni; negli stessi anni venivano utilizzati colliri contenenti tracce di argento per trattare le parti venute a contatto con agenti patogeni, che infettavano sia gli organi interni che la cute. Le ferite infette venivano trattate con soluzioni d’argento, considerando anche l’efficacia, seppur empiricamente osservata, di rigenerazione tissutale. Quest’uso è continuato più o meno in modo indiscusso fino all’incirca al 1940, quando furono sviluppati i moderni antibiotici, per cui l’uso dell’argento come agente antimicrobico diminuì drasticamente (Chopra I. et al., 2007).

Recentemente, tuttavia, proprio la diffusione delle antibiotico-resistenze insieme agli effetti tossici degli antibiotici (Morgun A. et al., 2015) stessi ha fatto riaccendere l’interesse per l’uso di questo metallo. D’altro canto, una delle riserve sull’utilizzo dell’argento è dovuta al fatto che, essendo quest’ultimo un metallo, potrebbe provocare avvelenamento nell’organismo. Utilizzi eccessivi dell’argento potrebbero comportare effetti tossici come per esempio lo sviluppo di una patologia denominata Argiria, consistente in una colorazione blu-grigiastra della pelle, delle mucose e degli occhi causata dal deposito di sali d’argento nei tessuti (Becker R.O.,1999). È riconosciuto che la causa più frequente di Argiria o Argirosi sia l’esposizione prolungata ad alte dosi di argento, generalmente ingerito o inalato, sotto varie forme. Tuttavia l’Argiria è prevalentemente una conseguenza della professione esercitata a contatto diretto con il metallo e non è in relazione con l’utilizzo sporadico di argento (Lansdown A.B. et al., 2007). Risulta così necessario precisare che si tratta di situazioni in cui si è superato di centinaia o migliaia di volte la dose giornaliera eventualmente consigliata.

In risposta alla eventuale tossicità riscontrata con l’uso di argento ionico, negli ultimi anni si è diffuso l’utilizzo di argento colloidale costituito da nanoparticelle di argento in soluzione acquosa, che sembra avere minori effetti tossici e inalterata efficacia antibatterica.

Tuttavia gli studi sulla sua efficacia e tossicità sono ancora non completamente chiariti.

Pertanto scopo della nostra analisi è stato quello di valutare gli effetti di una preparazione di argento colloidale distribuito dalla ditta Santé Naturels® sia su cellule procariotiche che eucariotiche mediante saggi in vitro.

MATERIALI E METODI

Argento utilizzato

L’argento colloidale utilizzato proviene dalla ditta Santé Naturels SNC (Via Isonzo 32, Civitanova Marche, Italia) che si occupa di prodotti naturali per la salute e il benessere, specializzata nella produzione e distribuzione di prodotti colloidali. L’argento colloidale è stato ricevuto già in soluzione e utilizzato come indicato nei vari esperimenti. L’argento ionico utilizzato come controllo è sotto forma di AgNO3 disciolto in acqua bidistillata alla concentrazione di 20 µg/ml.

Ceppi Batterici e fungini utilizzati

I ceppi batterici utilizzati in questo studio sono i seguenti:

Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Shigella sonnei (ATCC25931), Escherichia coli (DH5a), Pseudomonas aeruginosa (PO1). Il ceppo fungino è Candida albicans

(ATCC 10231).

Cellule umane utilizzate

HaCat (linea di cheratinociti umani spontaneamente immortalizzati); HeLa (linea di adenocarcinoma della cervice uterina); Caco-2 (Linea di adenocarcinoma di colon); HDF (Human Dermal Fibroblast).

Saggio di attività antibatterica su piastra

Aliquote di 100 µl dei diversi ceppi batterici in fase esponenziale di crescita sono stati mescolati con 10 ml di terreno di coltura LB e soft agar (0.7%). Sulle piastre sono stati fatti spot di 10 µl (200 ng) e 20 µl (400 ng) di argento colloidale o di argento ionico o ampicillina (25 ng). Le piastre sono state incubate ON a 37 °C.

Saggio di attività antibatterica in liquido

Sono stati condotti due tipi di saggi in liquido.

A)    i ceppi batterici indicati sono stati cresciuti fino alla fase stazionaria, quindi diluiti e fatti crescere in presenza di diverse concentrazioni di argento colloidale (2 µg/ml, 4 µg/ml, 8 µg/ml, 10 µg/ml) e argento ionico come controllo (4 µg/ml, 6 µg/ml) per 16 ore. Per valutare la crescita batterica si sono misurate le densità ottiche a 600 nm mediante uno spettrofotometro.

B)    i ceppi indicati sono stati cresciuti fino alla fase stazionaria, quindi diluiti e fatti crescere per due ore in presenza di due diverse concentrazioni di argento colloidale (2 µg/ml, 0.5 µg/ml). Al termine delle due ore le cellule sono state piastrate a diverse diluizioni in modo da calcolare il numero di cellule vitali in grado di formare colonie (CFU) in seguito al trattamento.

Saggio di tossicità su cellule umane

Sono stati condotti saggi MTT su cellule umane in coltura. Il saggio MTT, la cui sigla indica il composto bromuro di-3-(4,5- dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio, consente una valutazione colorimetrica dell’attività del metabolismo mitocondriale delle cellule trattate. In particolare, la succinato deidrogenasi, riduce l’MTT a formazano sviluppando un colore che diviene indice dell’attività mitocondriale e dunque della vitalità delle cellule.

Le cellule sono state piastrate e il giorno successivo è stato sostituito il terreno di coltura con mezzo fresco contenente argento colloidale o argento ionico a diverse concentrazioni. Dopo 24 ore è stato aspirato il terreno contenente l’argento e le cellule sono state trattate con la soluzione di MTT per 3 ore. Il risultato dell’esperimento è stato rilevato mediante lettura allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 570 nm.

RISULTATI

Saggi di attività antibatterica in piastra

Allo scopo di valutare l’attività antibatterica dell’Argento Colloidale nei confronti di diversi ceppi di batteri sia Gram + (Staphylococcus aureus, Lysteria monocytogenes) che Gram – (Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Shigella sonnei) sono stati allestiti saggi di attività antibatterica su piastra (vediMateriali e Metodi). Come si può osservare in Figura 1, la presenza di argento colloidale, cosi come di argento ionico, sia alla quantità di 200 ng che di 400 ng determina inibizione della crescita batterica dei vari ceppi analizzati, incluso Lysteria monocytogenes per il quale si riscontra una minore sensibilità all'argento sia ionico checolloidale.

 Saggi di attività antibatterica in liquido

Allo scopo di valutare in maniera più precisa l’azione dell’argento sui vari ceppi, abbiamo allestito due tipi di saggi di attività in liquido (vedi Materiali e Metodi).

A) in un primo tipo di saggio abbiamo valutato l’attività dell’argento colloidale a varieconcentrazioni (2,4,8,10 µg/ml) durante 16 ore di incubazione ON a 37 °C.

Come si può osservare nella Figura 2 , l’argento colloidale esercita un effetto dose dipendente su tutti i ceppi analizzati con un effetto di inibizione della crescita di circa il 40% alla concentrazione di argento colloidale di 2 µg/ml e dell’ 80-85% alla concentrazione di argento colloidale di 10 µg/ml. Anche in questo tipo di saggio si conferma l’insensibilità di Lysteria monocytogenes all’azione dell’argento.

B) abbiamo condotto un’analisi più approfondita per valutare se l’effetto esercitato dall’argento fosse di inibizione della crescita (effetto citostatico) oppure di induzione della morte cellulare (effetto citotossico). Abbiamo scelto di condurre l’analisi su un batterio Gram – rappresentativo (Escherichia coli) e su un batterio rappresentativo Gram + (Staphylococcus aureus ) e abbiamo introdotto un microrganismo eucariotico (Candida albicans) nell’analisi. Le crescite sono state condotte per solo due ore (vedi Materiali eMetodi) in presenza di quantità molto più basse di argento colloidale (0.5 µg/ml e 2 µg/ml) e la valutazione dell’effetto è stata condotta mediante piastratura e conta vitale. Come si può osservare in Figura 3, l’applicazione di argento colloidale esercita un notevole effetto citotossico sia alla concentrazione di 2 µg/ml (75 -90% di mortalità) che alla concentrazione ancora più bassa di 0.5 µg/ml (50-70% di mortalità) sia su Escherichia coli che su Candida albicans . Viceversa l’effetto è praticamente inesistentesu Staphylococcus aureus, indicando un effetto meno marcato dell’argento sui batteri Gram + (vedi anche Figura 2 e dati non mostrati).

Queste analisi, nel loro insieme, suggeriscono che l’argento colloidale esercita un discreto effetto antibatterico/antifungino nelle condizioni da noi osservate, con un effetto prevalente sui batteri Gram-. I nostri dati sembrano inoltre suggerire che l’effetto sia di tipo soprattutto citotossico dal momento che osserviamo una notevole mortalità a due ore dal trattamento con basse concentrazioni di argento (0.5 e 2 µg/ml).

Figura 1. Saggio di attività antibatterica in piastra.

 In figura sono visibili gli spot di inibizione della crescita batterica in presenza di Argento Colloidale (AgC) 200 ng e 400 ng (destra delle piastre) e, come controllo, in presenza di ampicillina (amp) e Argento Ionico (AgI) 200 ng e 400 ng (sinistra delle piastre).

Figura 2. Saggio di attività antibatterica in liquido.(A)

La figura mostra la percentuale di inibizione della crescita batterica condotta per 16 ore a 37°C in presenza di diverse concentrazioni di argento colloidale (barre in blu) e argento ionico (barre in grigio). Il metodo utilizzato è stato quello della lettura spettrofotometrica.

Figura 3. Saggio di attività in liquido. (B)

La figura mostra la percentuale di inibizione della crescita condotta per 2 ore a 37°C in presenza di due diverse concentrazioni di argento colloidale. Il metodo utilizzato è stato quello della conta vitale.

Saggi di tossicità su cellule umane

Abbiamo valutato l’eventuale tossicità dell’argento colloidale su diversi tipi di cellule umane in coltura (vedi Materiali e Metodi).

A tale scopo abbiamo deciso di utilizzare il saggio MTT, un test di vitalità cellulare, che permette di quantificare l’attività di un enzima mitocondriale che funziona solo nelle cellule vive. Pertanto, nelle cellule con un metabolismo basso, quindi con una vitalità limitata, l’MTT viene ridotto molto poco; al contrario, le cellule in rapida divisione mostrano alti tassi di riduzione di MTT.

Come si può osservare in Figura 4, il trattamento con argento colloidale alla concentrazione di 2 µg/ml non determina alcun effetto tossico sia su cellule tumorali della cervice uterina (HeLa) che su cheratinociti immortalizzati (HaCat) e fibroblasti dermali normali (HDF). A concentrazioni più elevate (4 µ g/ml) si ha un lieve effetto tossico con una riduzione della vitalità cellulare che va dal 30 al 55 % circa. Al contrario, l’argento ionico, utilizzato come controllo positivo, esercita un notevole effetto sulla vitalità, determinando un drastica diminuzione della vitalità delle cellule alla concentrazione più alta utilizzata. Gli stessi esperimenti sono stati effettuati anche su cellule Caco-2 (adenocarcinoma di colon) fornendo simili risultati (dati non mostrati).

Figura 4. Saggio di vitalità cellulare su cellule eucariotiche

La figura mostra la vitalità cellulare di cellule umane (cheratinociti immortalizzati, cellule di tumore della cervice uterina, fibroblasti dermali normali) trattate con due diverse concentrazioni (2 µg/ml; 4 µg/ml) di argento ionico (barre in grigio) o argento colloidale (2 µg/ml; 4 µg/ml) (barre in blu).

Referenze

-   Chopra I. “The increasing use of silver-based products as antimicrobial agents: a useful development or a cause for concern?” Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2007) 59, 587–590 doi:10.1093/jac/dkm006

-   Landsdown AB, Williams A., “Bacterial resistance to silver in wound care and medical devices”. J Wound Care (2007) Jan;16(1):15-9.

-   Morgun A, Dzutsev A, Dong X, Greer RL, Sexton DJ, Ravel J, Schuster M, Hsiao W, Matzinger P, Shulzhenko N. “Uncovering effects of antibiotics on the host and microbiota using transkingdom gene networks.” Gut. 2015 Nov;64(11):1732-43. doi: 10.1136/gutjnl-2014-308820. Epub 2015 Jan 22.

Napoli, 18 Aprile 2016

Prof. Alessandra Pollice                                                                                                                                         Prof. Ezio Ricca Direttore Dipartimento di Biologia

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