LO STUDIO SCIENTIFICO SULL'ARGENTO COLLOIDALE

L'argento colloidale induce la ristrutturazione del citoscheletro
e il reclutamento della E-Caderina nei contatti tra cellula e cellula tra le cellule HaCaT


Elena Montano (1,+), Maria Vivo (1,+), Andrea Maria Guarino (1), Orsola di Martino (1), Blanda di Luccia (1), Viola Calabrò (1), Sergio Caserta (2,*) e Alessandra Pollice (1,*).

Ricevuto: 11 aprile 2019 / Accettato: 14 maggio 2019 / Pubblicato: 15 maggio 2019 

Sommario: Fino alla prima metà del 20° secolo, l'argento ha trovato un significativo impiego nelle applicazioni mediche, in particolare nella cura delle ferite aperte, grazie alle sue proprietà antibatteriche e antifungine. La riparazione delle ferite è un processo biologico complesso e dinamico, regolato da diverse soluzioni che cooperano per ripristinare l'integrità dei tessuti e l'omeostasi. Per facilitare la guarigione, le ferite hanno bisogno di essere trattate rapidamente. Recentemente, l'interesse verso le alternative agli antibiotici è aumentato a causa del crescente fenomeno della resistenza agli antibiotici. Tra queste alternative, l'uso dell'argento appare essere una valida opzione e recentemente si è assistito ad un ritorno al suo utilizzo. In particolare, in contrasto con l'argento ionico, l'argento colloidale, una sospensione di particelle di argento metallico, mostra un'attività antibatterica con una minore o assente tossicità. Comunque, i rischi per la salute umana associati all'esposizione alle nanoparticelle di argento (NP) sembrano in conflitto, e alcuni studi hanno che potrebbe essere tossico in alcuni contesti cellulari. Questi effetti potenzialmente nocivi delle nanoparticelle di argento dipendono da vari parametri, inclusa la grandezza delle nanoparticelle, il cui valore comunemente varia dagli 1 ai 100 nm. In questo studio, analizziamo l'effetto di una preparazione di argento colloidale composta da nanoparticelle veramente piccole ed omogenee di 0,62 nm di grandezza, più piccole di quanto precedentemente testato. Non abbiamo riscontrato effetti avversi nella proliferazione delle cellule HaCaT, anche con un'alta concentrazione di nanoparticelle. La microscopia time-lapse e gli esperimenti di immunofluorescenza indiretta hanno dimostrato che questa preparazione di argento colloidale ha fortemente incrementato la migrazione cellulare, rimodellato il citoscheletro e causato il reclutamento della E-caderina nelle congiunzioni tra cellula e cellula dei cheratinociti umani coltivati.

Parole chiave: argento colloidale; cura delle ferite; E-caderina; cheratinociti; nanoparticelle; pelle.

1. Introduzione

L'uso dell'argento nelle applicazioni terapeutiche ha origini davvero antiche, dovute alla sua ampia e altissima efficacia antibatterica [1,2]. Comunque, il dibattito scientifico sul meccanismo con cui esso agisce è ancora un campo aperto. Alcuni autori ritengono che l'attività battericida potrebbe essere legata al rilascio di ioni di argento [3-8] e alla loro interazione con svariate componenti batteriche come i peptidoglicani, la membrana cellulare, così come gli enzimi e le proteine batteriche coinvolti nel processo vitale [8-11]. Di contro, altri autori asseriscono che l'effetto dell'argento potrebbe essere dovuto ad un effetto fisico verso la membrana cellulare con una conseguente penetrazione dell'argento nel citoplasma e interferenza con le componenti cellulari [10]. Più recentemente, è stato descritto un altro importante effetto esercitato dalle preparazioni di argento, che riguardava l'inibizione della formazione del biofilm batterico [12,13]. I biofilm (aggregati di batteri incorporati in una matrice extracellulare) consentono la crescita batterica in un ambiente protetto, riducendo la suscettibilità antibiotica e favorendo un allontanamento dalla risposta immunitaria. In aggiunta a queste funzioni, è stato dimostrato che l'argento ha effetti antinfiammatori e migliora la guarigione delle ferite tramite la modulazione delle citochine fibrogeniche e tramite la diminuzione nell'infiltrazione dei linfociti [17,18]. Così, l'argento ha trovato ampie applicazioni nella prevenzione di ulteriori danni e l'invasione batterica delle ferite, migliorando perciò l'efficiente recupero dei tessuti danneggiati. Tutte queste caratteristiche hanno favorito un ampio utilizzo dell'argento, sia in medicina che nella vita quotidiana. Oggigiorno, i dispositivi medici (bendaggi per le ferite, cateteri chirurgici, punti, cemento osseo), allo stesso modo dei cosmetici, cosmeceutici e tessili, hanno una componente in argento [13,16,19,20]. Nondimeno, sebbene sia considerato relativamente non tossico per i mammiferi, la cronica esposizione agli ioni positivi dell'argento determina la formazione di precipitati insolubili nel derma e nella cornea/congiuntiva, causando la cosiddetta argiria o sindrome argiriosa, una colorazione blu della pelle e delle mucose [3,4]. È essenziale sottolineare che la maggior parte della tossicità dell'Argento c'è perché l'Argento ionico (Ag+) è eccezionalmente reattivo verso le molecole e le strutture cellulari [21]. Perciò, specialmente durante gli ultimi anni, l'utilizzo dell'argento ionico è stato soppiantato dall'argento colloidale, ad esempio, come sospensione di microscopiche nanoparticelle metalliche (NP fino a 100 nm di diametro), presentando una minore tossicità in relazione alla loro controparte metallica [3,4]. Le nozioni riguardanti la sicurezza e la biocompatibilità dell'argento colloidale sono talvolta sembrate essere contraddittorie nella letteratura. Diversi studi hanno confermato le nanoparticelle di argento come clinicamente sicure [22] e i bendaggi basati sulle nanoparticelle di argento sono stati dichiarati sicuri per i pazienti [20,23,24]. Ad ogni modo, alcuni studi hanno mostrato che le nanoparticelle sono citotossiche per svariate linee cellulari differenti, principalmente causando un aumento della produzione ROS, una decrescita della funzione mitocondriale, danni al DNA e l'apoptosi [25-30]. In altri casi, è stata riportata una diminuzione della proliferazione cellulare senza danni al DNA [31]. Di contro, gli studi eseguiti sui fibroblasti umani hanno confermato che le nanoparticelle di Argento potrebbero alterare la funzionalità mitocondriale senza condurre le cellule alla morte [16] e uno studio ha identificato una relazione tra la grandezza delle nanoparticelle e gli effetti inibitori sul mitocondrio [32]. Bisogna sottolineare che le nanoparticelle di Argento possono essere davvero eterogenee e tale eterogeneità potrebbe probabilmente spiegare, in parte, le differenze presenti in letteratura. Sono stati sviluppati svariati metodi per produrre le nanoparticelle di Argento. Le preparazioni di Argento colloidale reperibili in commercio (vedere http://www.silver-colloids.com/) possono differire per la grandezza delle nanoparticelle, la stabilità (potenziale Zeta), la concentrazione e differenti percentuali di Argento ionico dovute o all'efficienza, o ai metodi di sintesi. I parametri influenzati dal metodo di sintesi includono la grandezza e il diametro della nanoparticella maggior, la distribuzione della grandezza, la forma, la stabilità, l'inclusione di involucri di ligando e agenti di copertura [21].

Considerando l'ampio utilizzo delle nanoparticelle di Argento e il crescente interesse verso il suo uso dovuto alla sua versatilità, abbiamo analizzato le proprietà biologiche di una preparazione di Argento colloidale con nanoparticelle di Argento di 0,62 nm di grandezza, più piccole di quelle mai descritte e che presentano una percentuale estremamente bassa di Argento ionico [33-35]. Per prima cosa abbiamo valutato l'attività antimicrobica con risultati similari a ciò che è stato già pubblicato [36-39] con i dati non mostrati. Poi, abbiamo valutato l'effetto su un modello di pelle umana, HaCaT cheratociti. Abbiamo notato un'assenza di tossicità tramite la prova MTT, l'analisi della curva di crescita, l'assenza di granuli di stress e una forte efficacia nel promuovere la guarigione delle ferite in vitro. E' interessante notare che l'Argento colloidale ha indotto un'evidente riorganizzazione citoscheletrica accompagnata da un incremento delle congiunzioni tra cellula e cellula, sottolineate da un reclutamento della E-caderina.

2. Risultati

2.1 Effetti dell'Argento colloidale sulle cellule HaCaT

Gli esperimenti iniziali hanno indagato la potenziale tossicità dell'Argento colloidale sui cheratinociti umani immortalizzati. A questo scopo, le cellule HaCaT sono state coltivate in presenza di Argento colloidale o ionico a 0,5 o 2 mg/mL per 24h e 48h e la vitalità cellulare è stata analizzata tramite il test MTT come descritto in [40]. La figura 1 mostra che l'Argento colloidale non ha sortito alcun effetto tossico, mentre l'Argento ionico ha causato una drammatica riduzione della vitalità delle cellule ad entrambe le concentrazioni.

É importante sottolineare che la vitalità cellulare è cresciuta tra le 24 e le 48 ore anche quando l'Argento colloidale è stato aggiunto nella più alta concentrazione di 2 mg/mL, non evidenziando così alcuna tossicità in queste condizioni. Abbiamo quindi indagato se l'Argento colloidale potrebbe funzionare come agente di stress analizzando la formazione dei granuli di stress (SG). Gli SG sono aggregati di proteine e RNA che si formano quando le cellule sono sottoposte a differenti tipi di stress per proteggere le strutture cellulari dalle condizioni dannose. Per monitorare la formazione di questi aggregati, abbiamo guardato alla proteina YB-1 come uno marcatore specifico di SG [41]. Inoltre, è stato notato che YB-1 tipicamente trasmigra verso il nucleo a seguito di stress genotossico [42], perciò può anche essere utilizzato per controllare il pericoloso assalto alle cellule. Le cellule HaCaT sono state coltivate in presenza di Argento colloidale a 0,5 e 2 mg/mL per 24h, stabilizzate e analizzate tramite l'IF indiretto con l'anticorpo anti-YB1. La figura 2 mostra chiaramente che l'Argento colloidale non ha indotto né la formazione di granuli di stress, né la trasmigrazione nucleare YB-1. Le cellule sono state inoltre colorate con la falloidina unita al TRITC per visualizzare il citoscheletro di actina. L'esperimento ha mostrato che il trattamento con l'Argento colloidale ha indotto una riorganizzazione del citoscheletro di actina alla periferia cellulare. In particolare, abbiamo osservato un incremento della polimerizzazione di f-actina nelle adesioni sia tra cellula e cellula che tra cellula e substrato (figura 2, pannelli rossi).

(Fig. 1: gli effetti dell'Argento colloidale sulla vitalità delle cellule HaCaT. Il test MTT delle cellule HaCaT incubate per 24h o 48h con Argento colloidale (barre grigie) o ionico (barre scure) a 0,5 o 2 mg/mL. I dati sono espressi come assorbanza a 570 nm e presentati come la media – più o meno – SE di tre esperimenti indipendenti, ciascuno di essi in sestuplicato. L'analisi della varianza è stata svolta a doppio senso dal post-test Bonferroni. **** P<0,0001 quando comparato con il controllo).

(Fig. 2: gli effetti dell'Argento colloidale sulla formazione dei granuli da stress.  Le cellule HaCaT sono state seminate su un vetrino e trattate (o no) con Argento colloidale a 0,5 o 2 mg/mL per 24h. Sono state poi stabilizzate e analizzate con la colorazione di falloidina unita al TRITC (rosso) o con l'IF indiretto con l'anticorpo anti-YB1 (verde). I nuclei sono stati colorati con DAPI. La barra della scala, 7 mM. Le immagini sono state acquisite tramite una Nikon TE Eclipse 2000).

2.2. Effetti dell'Argento colloidale sulla guarigione delle ferite

Sulla base di questi dati che mostrano una riorganizzazione del citoscheletro di actina, abbiamo deciso di analizzare l'effetto dell'Argento colloidale sulla migrazione cellulare, un processo in cui hanno luogo massicce dinamiche del citoscheletro. La guarigione delle ferite è stata valutata in vitro mediante una microscopia time-lapse automatica [43]. I dettagli relativi alla tecnica sono riportati nella sezione Materiali e Metodi. Le immagini tipiche della ferita come una funzione temporale sono presentate in figura 3A, dove sono comparati i campioni in assenza e/o in presenza di Argento colloidale 0,5 mg/mL.

Le immagini allo stesso tempo indicano una migliore chiusura della ferita per il campione trattato rispetto al controllo. Questo risultato è stato sistematico, come visibile dalla figura 3B,C, in cui l'evoluzione dell'area ferita, normalizzata rispetto al suo valore iniziale (A/A0), è riportata rispettivamente per il controllo e il campione trattato. I dati grezzi riportati nei due diagrammi per ciascun campo visivo indipendente hanno mostrato una riproducibilità eccellente. Abbiamo calcolato i valori della velocità di chiusura della ferita (a) per ciascuna serie di dati, come riportato nella sezione Materiali e Metodi. E' interessante notare che l'aAgC/acontr (che è una misura dell'effetto relativo del trattamento nelle nostre condizioni) era 1,80, indicando che la velocità di chiusura della ferita è approssimativamente raddoppiata in presenza dell'Argento colloidale 0,5 mg/mL.

Nella figura 4B, è riportato il tempo di duplicazione (t) delle cellule HaCaT cresciute in presenza e/o assenza dell'Argento colloidale 0,5 mg/mL. Curiosamente, la duplicazione cellulare non è stata alterata in modo significativo dalla presenza dell'Argento colloidale, mentre il coefficiente di mobilità cellulare dell'equazione di Fisher-Kolmogoroff è apparso incrementato in maniera drasticamente e statisticamente significativa (figura 4C). Soprattutto, questi risultati indicano che durante sotto queste condizioni sperimentali, l'Argento colloidale ha condizionato la mobilità cellulare più della proliferazione cellulare.

(Fig. 3: effetti dell'Argento colloidale sulle dinamiche di chiusura delle ferite. (A) Immagini di microscopia a contrasto rappresentative delle cellule incubate (o no) con Argento colloidale in momenti diversi, mostrano il processo di chiusura della ferita nel tempo. (B,C) Il processo di chiusura della ferita è stato quantificato misurando la riduzione della superficie della ferita nel tempo (A), come descritto nella sezione Materiali e Metodi. L'evoluzione della ferita area A, normalizzata fino al valore A0 (A al tempo 0), viene riportata per il controllo (B) e le cellule trattate con Argento colloidale ( C ) selezionando a caso delle zone lungo la ferita per ciascun esperimento. La gamma lineare di ciascuna serie di dati era adeguata per misurare la velocità a di chiusura della ferita. I valori di a per il controllo e le cellule trattate sono indicate in ciascun grafico come la media di tre esperimenti indipendenti analizzati in triplice copia. É stato calcolato un errore standard della media per tenere conto della riproducibilità, e il t-test è stato calcolato per verificare il significato delle differenze rispetto ai campioni di controllo).

(Fig. 4: effetti dell'Argento colloidale sulle dinamiche della chiusura delle ferite. Vengono riportati i valori di a(velocità di chiusura della ferita) (A), (t tempo di duplicazione) (B), e (D) (coefficiente di mobilità cellulare) ( C ) del controllo e le cellule trattate con Argento colloidale. I valori di D sono stati calcolati in accordo con l'equazione di Fisher-Kolmogoroff dai valori di a e t(vedere Materiali e Metodi). I dati sono espressi come la media di almeno 3 esperimenti indipendenti. SEM è riportato come barre di errore, la significatività statistica è stata valutata dal t-test a due code abbinato (*P=0,04; **P=0,007).

2.3. Effetto dell'Argento colloidale sul contatto tra cellula e cellula e morfologia cellulare

La regolazione della forma e della vitalità cellulare è governata in larga parte dal citoscheletro, di cui i filamenti di actina sono i maggiori componenti. Gli elementi citoscheletali influenzano la formazione delle adesioni tra cellula e cellula e tra cellula e substrato che giocano un ruolo fondamentale sia nella morfologia che nella migrazione cellulare che richiede il continuo assemblarsi e disgregarsi delle adesioni cellulari. Per caratterizzare ulteriormente gli effetti dell'Argento colloidale sulla forma della cellula, il citoscheletro e i contatti tra cellula e cellula sono stati esaminati mediante microscopia alla fluorescenza sia colorando la falloidina che con l'immunofluorescenza della E-caderina. Le cellule sono state lasciate sul vetrino per tutta la notte, trattate con Argento colloidale a 0,5 mg/mL per 8 ore, stabilizzate e soggette all'immunofluorescenza con l'anti E-caderina, seguite dall'incubazione della falloidina unita al TRITC per visualizzare il citoscheletro di actina e il DAPI per colorare il nucleo. Come osservato in precedenza, le cellule hanno mostrato un denso reticolo di filamenti di actina attorno alla periferia cellulare. É interessante notare che gli esperimenti hanno rilevato che il trattamento con Argento colloidale hanno causato un significativo reclutamento di E-caderina nelle congiunzioni tra cellula e cellula, che apparivano entro 8 ore dal trattamento (fig. 5). Risultati simili sono stati ottenuti quando le cellule sono state incubate con Argento colloidale per 24 ore.

(Fig. 5: localizzazione della E-caderina nelle cellule HaCaT sotto trattamento con Argento colloidale. Le cellule sono state lasciate aderire al vetrino per 24 ore e poi trattate con Argento colloidale a 0,5 mg/mL per 8 ore. Le cellule sono poi state stabilizzate e sottoposte ad immunofluorescenza con un anticorpo anti E-caderina, seguito dalla falloidina unita al TRITC per visualizzare il citoscheletro di actina. Vengono mostrate immagini rappresentative della localizzazione subcellulare della E-caderina e della falloidina. Le immagini insieme mostrano la coloritura con DAPI per visualizzare il nucleo. Le immagini sono state scattate con un microscopio a scansione laser confocale Zeiss Axio Observer (barra di scala, 15 mM). E' stato usato un obiettivo x40 e l'analisi dell'immagine è stata effettuata utilizzando ImageJ).

3. Discussione

In questo lavoro, abbiamo valutato l'effetto dell'utilizzo di una soluzione di Argento colloidale sulla vitalità e migrazione cellulare dei cheratinociti umani immortalizzati. Sebbene l'utilizzo dell'Argento in medicina risalga ai tempi antichi, esso è divenuto meno frequente grazie all'ampia diffusione degli antibiotici. La comparsa negli ultimi decenni del crescente e pericoloso fenomeno di resistenza agli antibiotici ha riportato alla luce l'uso dell'argento come una valida alternativa non tossica. I nostri esperimenti hanno mostrato che non si possono riscontrare effetti avversi nelle cellule HaCaT sia con il test MTT che con la formazione di granuli di stress, quando abbiamo trattato i cheratinociti anche alle concentrazioni più alte di Argento colloidale (2 mg/mL). Va notato che, sotto trattamento, le cellule tendono a riorganizzare il citoscheletro come indicato dall'osservazione della f-actina colorata con la falloidina. Poiché la guarigione delle ferite è legata ad una profonda riorganizzazione del citoscheletro, abbiamo analizzato l'influsso dell'Argento su tale guarigione seguendone il processo tramite la video microscopia time-lapse. L'algoritmo che abbiamo usato ha permesso l'analisi quantitativa delle dinamiche di riduzione dell'area di taglio. I nostri dati hanno indicato che in presenza dell'Argento, la velocità di chiusura della ferita è aumentata e le cellule incubate con Argento colloidale hanno curato l'area danneggiata in un tempo minore rispetto ai controlli. Questo risultato è stato quantificato e interpretato sulla base del modello Fisher-Kolmogoroff, che consente di descrivere matematicamente il processo di chiusura del taglio. E' stato impiegato un nuovo modo di analizzare i dati per identificare il ruolo della mobilità e della proliferazione cellulare nella guarigione della ferita attraverso semplici calcoli. Abbiamo scoperto che l'Argento colloidale ha aumentato il meccanismo di migrazione cellulare invece di aumentarne i livelli di proliferazione. La mobilità cellulare è primariamente regolata da citoscheletro, che influenza i contatti sia tra cellula e cellula, sia tra cellula e substrato. I nostri risultati sono stati supportati dagli esperimenti di immunofluorescenza, in cui le cellule HaCaT hanno presentato un segnale di aumento generale di E-caderina e la sua ricollocazione verso la periferia cellulare e le zone di contatto tra cellula e cellula. É interessante notare che è stato rilevato che le congiunzioni intercellulari contrassegnate dalla E-caderina permettono alle cellule di comunicare [44] e di muoversi in modo altamente coordinato [45]. L'aumento delle giunzioni tra cellula e cellula attraverso i forti contatti mediati dalla E-caderina al margine superiore, nelle zone laterali e nel gruppo di cellule in movimento, caratterizza tutta la migrazione cellulare. Questo è un aspetto particolarmente interessante, perché la migrazione cellulare collettiva sarebbe la base del movimento e della proliferazione dei cheratinociti epidermici collocati sul bordo della ferita in seguito a lesioni cutanee [49]. Va notato anche che i movimenti cellulari sono caratterizzati da una riorganizzazione del citoscheletro tramite la formazione di giunzioni aderenti [49]. Tali giunzioni, favorite dal reclutamento della E-caderina sulla superficie cellulare, consentono un ancoraggio al citoscheletro di actina [50] tramite il loro legame con le catene a e b. L'aumento della polimerizzazione di actina indotto dall'Argento colloidale e il trasferimento della E-caderina alle giunture tra cellula e cellula indicano entrambi che l'Argento colloidale è ampiamento coinvolto nella riorganizzazione del citoscheletro che avviene durante la migrazione. Concordemente, è stato osservato che le nanoparticelle di Argento sono capaci di aumentare la comunicazione intercellulare giunzionale di Connexina 43-gap nelle cellule HaCaT [51]. É interessante sottolineare che questo accade attraverso la produzione di ROS e l'attivazione del percorso MAPK. Inoltre, in un modello in vitro dell'epitelio intestinale umano, l'esposizione alle nanoparticelle di Argento ha causato cambiamenti nella permeabilità cellulare e una disregolazione nell'espressione di componenti di giunzioni e demosomi stretti senza influenzare la E-caderin; comunque, va notato che questi esperimenti sono stati effettuati con nanoparticelle di 10 nm di taglia, circa 18 volte più grandi di quelli utilizzati nel presente studio [52].

4. Conclusioni

Complessivamente, i presenti dati indicano che l'Argento colloidale potrebbe migliorare il processo di guarigione modulando la riorganizzazione del citoscheletro e, così, la mobilità cellulare. É necessaria un'ulteriore analisi per chiarire sia il meccanismo di azione che il percorso molecolare coinvolti. Ad ogni modo, i dati raccolti incoraggiano a svolgere ulteriori indagini sull'uso dell'Argento colloidale nella guarigione dei tessuti. A tal proposito, gli agenti terapeutici che includono steroidi, glucocorticoidi, farmaci antinfiammatori non steroidei e chemioterapia sono associati con diversi effetti collaterali che, interferendo con il movimento cellulare nella ferita, rallentano il processo riparatorio [53]. In questo scenario, l'Argento potrebbe avere un effetto positivo sulla chiusura delle ferite agendo a differenti livelli e con differenti meccanismi in paragone ai farmaci usati generalmente. Per ultimo ma non da ultimo, va sottolineato che grazie alle sue proprietà antimicrobiche l'Argento potrebbe essere una valida alternativa per il trattamento di infezioni causate anche da batteri con multi-resistenza agli antibiotici (MDRB) [54], che non rispondono alle consuete terapie farmacologiche e per cui è una vera sfida lo sviluppo di trattamenti efficaci.

5. Materiali e Metodi

5.1. Colture cellulari e reagenti

Le cellule HaCaT, cheratinociti immortalizzati spontaneamente dalla pelle adulta, sono stati acquistati dal Cell Line Service (CLS, Eppelheim, Germania) e coltivati con il Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS, Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA), con l'1% di L-glutamina e l'1% di penicillina-streptomicina (ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH, USA) a 37°C in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 [55,56]. A seconda del tipo di esperimento, le cellule HaCaT sono state seminate a diverse densità e su diversi piatti di coltura. Le cellule sono state trattate con una preparazione di Argento colloidale contenente il 79,5% di nanoparticelle di Argento di 0,62 nm di grandezza, ottenute dalla Santé Naturels SNC (Civitanova Marche, Macerata, Italia) alla concentrazione di 20 ppm (20 mg/mL). Informazioni dettagliate riguardanti le caratteristiche della soluzione di Argento colloidale sono visibili presso il seguente sito ufficiale: http://www.silver-colloids.com/ (cliccare sulla Tavola di Comparazione; Rapporto sui Prodotti Europei). Ulteriori informazioni riguardanti la grandezza delle nanoparticelle e il potenziale Zeta (indice di stabilità) sono presentati nei Materiali Aggiuntivi (S1,S2). Per ciascun esperimento, la soluzione madre è stata diluita in mezzo di coltura. L'Argento ionico è stato ottenuto dissolvendo 3,15 mg di AgNO3 in 100 ml di acqua (H2O) per ottenere una soluzione madre finale in cui l'Argento ionico sia a 20 mg/mL.

5.2 Test sulla vitalità cellulare (MTT) e sulla proliferazione cellulare

L'effetto dell'Argento ionico e colloidale sulla vitalità della cellula è stato valutato misurando la riduzione del -3(4,5-dimethylthiazolo-2)2,5-difeniltetrazolio bromide a formazano tramite la deidrogenasi mitocondriale [57,58]. Brevemente, 9x10celle sono state seminate su 96 piatti a pozzetti ed esposte a concentrazioni crescenti di Argento colloidale a 0,5 o 2 mg/mL per 24 o 48 ore. La soluzione MTT/PBS (0,5 mg/mL) è stata poi aggiunta ai pozzetti e incubata per 3 ore a 37°C in un'atmosfera umidificata. La reazione è stata interrotta con la rimozione del surnatante, seguita dalla dissolvenza del formazano nell'isopropanolo acido. La densità ottica è stata misurata con un lettore ELISA (Bio-Rad), usando un filtro a 570 nm che usa un lettore di micropiastre iMark (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Ciascun esperimento è stato svolto in quadruplicato, in tre esperimenti indipendenti. La vitalità della cella è stata calcolata come CV(%)=(assorbanza del campione del test/assorbanza del controllo)x100. Per l'analisi della proliferazione cellulare, le cellule sono state incubate con Argento Colloidale e il numero di cellule in ciascuna fase dell'esperimento è stato contato con un contatore Scepter-Millipore (contatore di cellule automatizzato palmare) come descritto in [59]. Le curve di crescita sono state generate e il tempo di duplicazione della popolazione cellulare (t) è stato stimato adattando una tipica logistica equazione di crescita [60], in cui t era il solo parametro variabile.

n(t)=n0*2(t/t)

5.3. Prova di abrasione della ferita in vitro 

Per testare l'effetto dell'Argento colloidale sulla chiusura della ferita, le cellule HaCaT sono state seminate in piastre a 12 pozzetti ad una densità di 4,5x105 cellule per pozzetto. Il giorno seguente alla posa sulle piastre, una volta che hanno raggiunto la confluenza del 90-100%, le cellule sono state lasciate senza alimentarle per 6 ore in un DMEM privo di siero per inibire completamente la proliferazione cellulare. Il monostrato confluente è stato raschiato con punte di pipette sterili P200 e lavato due volte con PBS per rimuovere le cellule e i detriti separati. I monostrati grattati sono stati trattati con Argento colloidale (0,5 mg/mL) diluito in mezzo di coltura e le piastre sono state incubate come descritto. La chiusura delle ferite è stata monitorata in campioni differenti tramite un microscopio automatizzato time-lapse (TLM) usando un microscopio invertito (Zeiss Axiovert 200, Carl Zeiss, Germania) inserito in un incubatore con costante temperatura (37°C), umidità (100% Hr) e CO2 (5%). Sono stati acquisiti differenti campi visivi in ciascuna piastra di cellule tramite un microscopio a contrasto di fase, usando una videocamera CCD (Hamamatsu Orca AG, Giappone) ad intervalli regolari (15 minuti) per circa 18 ore, usando un obiettivo 5x a lunga distanza di lavoro nella fase di contrasto (CP Achromat Ph1). Le immagini sono state analizzate come descritto in [43]. Le dinamiche di chiusura delle ferite sono state quantificate usando un software di analisi per immagini automatico autoprodotto, che ci ha permesso di misurare la grandezza della ferita in ciascun punto. In un tipico esperimento, per ciascun campo visivo, l'area nuda delle cellule (A) è stata misurata per ciascuna fase temporale, normalizzata in relazione al valore della ferita al tempo 0 (A0) e tracciata in funzione del tempo. Dopo un iniziale ritardo (tL), si è scoperto che A/Adecresceva a velocità costante; la pendenza del raggio lineare di  A/Avs la curva t (a) può essere considerata come una misura della velocità di chiusura della ferita. I dettagli sul calcolo di tL e a vengono riportati altrove (vedere fig. 9b in [61]). Per ciascuna condizione sperimentale (controllo e trattato), almeno 4 campi indipendenti sono stati analizzati su 3 pozzi indipendenti per ciascun esperimento. Ognuno è stato svolto in triplicato e un'analisi statistica è stata svolta calcolando l'errore standard della media (riportato come barra di errore) e calcolando il significato statistico testando l'ipotesi nulla (t-test).

5.4. Analisi dei dati sulla guarigione della ferita

Il processo di guarigione della ferita può essere modulato seguendo l'equazione di Fisher-Kolmogoroff (Equazione (2)), che è un'equazione di diffusione-reazione basata su un approccio al fenomeno dei trasporti [62,63]. Questo modello descrive matematicamente l'evoluzione del profilo u di densità cellulare, che dipende dal tempo e dalla distanza x, misurata lungo il bordo della ferita, per esempio nella direzione della chiusura, che è la direzione orizzontale nelle immagini riportate in questo lavoro. Due diversi fenomeni contribuiscono alla chiusura della ferita, per esempio la mobilità e la proliferazione cellulare, che sono entrambe coinvolte nella distribuzione di spazio delle cellule nella zona della ferita ed entrambe sommate nel lato destro dell'equazione.

du/dt = D d2u/dx2 + ku(1-u/ù) (2)

La mobilità cellulare è modellata come diffusione di Fick, secondo l'ipotesi di un movimento casuale delle cellule [64-66] e dipende da un coefficiente di movimento casuale, cioè analogo ad un coefficiente di diffusione (D, in equazione (2)). La proliferazione cellulare può essere modulata (ultimo termine in equazione (2)) come una crescita logistica, dove la velocità di crescita si riduce mentre la densità cellulare si avvicina alla confluenza, che viene misurata dalla massima densità cellulare ù.

K è una costante di crescita cinetica, che ad una prima approssimazione può essere stimata come il reciproco del tempo di duplicazione cellulare (k=ln2 (t)) [62,67]. Questo modello prevede che dopo una breve fase transitoria, i lembi della ferita si muovano a velocità costante nella direzione x, perpendicolari al bordo della ferita, riducendo la grandezza dell'area ferita. La velocità di propagazione di ciascun lembo della ferita è rapportata ai valori del coefficiente di mobilità casuale e del tempo di duplicazione cellulare (equazione (3)) [62,67].

v=√4Dln(2)/t (3)

Il ruolo concorrente della mobilità e della proliferazione cellulare può essere stimato con il semplice calcolo del modulo Thiele φ=b/2√K/D [62], in cui b rappresenta la grandezza iniziale della ferita, per esempio la distanza dei due lembi della ferita al tempo 0. Ricavata la misura della velocità a della chiusura della ferita dall'analisi degli esperimenti time-lapse, è stato semplice calcolare la velocità di propagazione dei lembi della ferita che è legata ad a da una semplice relazione geometrica v=a*b/2, in cui b è la grandezza iniziale della ferita, con estrema precisione. Il tempo di duplicazione della ferita t era calcolato indipendentemente dal test di proliferazione cellulare (equazione (3)). Il coefficiente di mobilità casuale D è stato finalmente calcolato dall'equazione inversa (3).

(D=t*v2/4ln(2)) (4)

Vale la pena menzionare che la misurazione diretta del coefficiente casuale della cellula è un compito non banale che richiede il monitoraggio del movimento cellulare nel tempo [43]. Il vantaggio dell'approccio qui utilizzato è la possibilità di stimare un così rilevante parametro dalla semplice analisi degli esperimenti di guarigione della ferita e da banali calcoli algebrici basati su modelli avanzati.

5.5. Immunofluorescenza 

I test di immunofluorescenza sono stati svolti come precedentemente descritto in [68,69]. Brevemente, le cellule HaCaT trattate e controllate sono state seminate su dei vetrini ad una densità di 1,5x105 cellule per pozzetto in piastre a 24 pozzetti, stabilizzate con PFA al 3,7% e permeabilizzate con 0,5% di Triton X-100. Dopo averle bloccate con un 3% di BSA, le cellule sono state incubate con anticorpi primari (E-caderina e YB-1) per 1 ora a RT seguito da una incubazione con anticorpi secondari coniugati Alexa-Fluor per 1 ora nell'oscurità. Per visualizzare il citoscheletro di actina, le cellule sono state colorate con falloidina coniugata con TRITC. Le cellule sono state messe a contrasto con DAPI per la visualizzazione del nucleo. Le immagini sono state catturate con un microscopio confocale Axio Observer a scansione laser Zeiss. É stato utilizzato un obiettivo x40 e l'analisi delle immagini è stata svolta con ImageJ. Tutte le immagini sono state rilevate con la stessa impostazione. L'elaborazione e l'analisi delle immagini è stata svolta con il software Fiji (ImageJ versione 2.0). L'esperimento di formazione dei granuli di stress è stato svolto come descritto in [70] e le immagini sono state acquisite usando una Nikon TE Eclipse 2000. Sono stati usati gli anticorpi di anti-YB1 (12148 Abcam, Cambridge, UK), anti E-caderina (610181 BD Translucidation LaboratoriesTM, MA, USA), Alexa-Fluor 488 anti-coniglio e anti-topo (Thermo-Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) e DAPI (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA).

5.6. Analisi statistica

Tutti i dati sono stati espressi come la media di esperimenti indipendenti (replicati biologici) + o – errori standard (SE). L'analisi della varianza è stata svolta con un duplice ANOVA seguito da un post-test Bonferroni che usava un Graph-Pad Prism (Software Graph-Pad), o da T-test dello studente come precedentemente descritto in [59].

a cura di Gino Riccardo Navarra → leggi la biografia

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