Studio di efficacia e tossicità di preparazioni di Argento Colloidale prodotto da Santé Naturels® eseguito presso l’UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II - Scuola Politecnica e delle Scienze di Base - Dipartimento di Biologia, con valutazione degli effetti sia su cellule procariotiche che eucariotiche mediante saggi in vitro.
Premessa del Dr. Domenico Martini
L’attività antibatterica dell’Argento Colloidale Santé Naturels® è stata valutata con saggi di attività antibatterica su piastra ed in liquido su ceppi batterici e fungini quali: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Il ceppo fungino è Candida Albicans. I risultati di questi saggi dimostrano che l’argento colloidale esercita un effetto antibatterico / antifungino rilevante confrontandolo con un antibiotico tradizionale utilizzato come controllo positivo.
Sono state valutate l’eventuale tossicità dell’argento colloidale su diversi tipi di cellule umane in coltura quali le HaCat (linea di cheratinociti umani); HeLa (linea di adenocarcinoma della cervice uterina); Caco-2 (Linea di adenocarcinoma di colon); HDF (Human Dermal Fibroblast) attraverso il saggio MTT, un test di vitalità cellulare. Il trattamento con argento colloidale di Santé Naturels® non determina effetti tossici nelle condizioni sperimentali analizzate. Al contrario, l’argento ionico, utilizzato come controllo positivo, esercita un notevole effetto tossico, determinando una drastica diminuzione della vitalità delle cellule anche a basse concentrazioni, quindi l'argento ionico presenta un alto grado di tossicità.
Possiamo concludere che questo studio effettuato dall’Università Federico II di Napoli ha dimostrato che l’argento colloidale di Santé Naturels® ha ottime proprietà antibatteriche ed antifungine ed è atossico nei confronti di diverse cellule in coltura alle condizioni analizzate.
L’argento colloidale della Santé Naturels® ha dimostrato importanti capacità cicatrizzanti per il tessuto epiteliale.
Dr. Domenico Martini
RELAZIONE SCIENTIFICA ANALISI SU
ARGENTO COLLOIDALE
SANTÉ NATURELS®
INTRODUZIONE
L’uso dell’argento nella pratica clinica e nella cura delle infezioni risale a tempi antichissimi. All’inizio del ventesimo secolo i chirurghi impiegavano punti d’argento di routine per le suture in modo da ridurre il rischio di infezioni; negli stessi anni venivano utilizzati colliri contenenti tracce di argento per trattare le parti venute a contatto con agenti patogeni, che infettavano sia gli organi interni che la cute. Le ferite infette venivano trattate con soluzioni d’argento, considerando anche l’efficacia, seppur empiricamente osservata, di rigenerazione tissutale. Quest’uso è continuato più o meno in modo indiscusso fino all’incirca al 1940, quando furono sviluppati i moderni antibiotici, per cui l’uso dell’argento come agente antimicrobico diminuì drasticamente (Chopra I. et al., 2007).
Recentemente, tuttavia, proprio la diffusione delle antibiotico-resistenze insieme agli effetti tossici degli antibiotici (Morgun A. et al., 2015) stessi ha fatto riaccendere l’interesse per l’uso di questo metallo. D’altro canto, una delle riserve sull’utilizzo dell’argento è dovuta al fatto che, essendo quest’ultimo un metallo, potrebbe provocare avvelenamento nell’organismo. Utilizzi eccessivi dell’argento potrebbero comportare effetti tossici come per esempio lo sviluppo di una patologia denominata Argiria, consistente in una colorazione blu-grigiastra della pelle, delle mucose e degli occhi causata dal deposito di sali d’argento nei tessuti (Becker R.O.,1999). È riconosciuto che la causa più frequente di Argiria o Argirosi sia l’esposizione prolungata ad alte dosi di argento, generalmente ingerito o inalato, sotto varie forme. Tuttavia, l’Argiria è prevalentemente una conseguenza della professione esercitata a contatto diretto con il metallo e non è in relazione con l’utilizzo sporadico di argento (Lansdown A.B. et al., 2007). Risulta così necessario precisare che si tratta di situazioni in cui si è superato di centinaia o migliaia di volte la dose giornaliera eventualmente consigliata.
In risposta alla eventuale tossicità riscontrata con l’uso di argento ionico, negli ultimi anni si è diffuso l’utilizzo di argento colloidale costituito da nanoparticelle di argento in soluzione acquosa, che sembra avere minori effetti tossici e inalterata efficacia antibatterica.
Tuttavia gli studi sulla sua efficacia e tossicità sono ancora non completamente chiariti.
Pertanto, scopo della nostra analisi è stato quello di valutare gli effetti di una preparazione di argento colloidale distribuito dalla ditta Santé Naturels® sia su cellule procariotiche che eucariotiche mediante saggi in vitro.
MATERIALI E METODI
Argento utilizzato
L’argento utilizzato proviene dalla ditta Santé Naturels SNC (Via Isonzo 32, Civitanova Marche, Italia) che si occupa di prodotti naturali per la salute e il benessere, specializzata nella produzione e distribuzione di prodotti colloidali. L’argento colloidale è stato ricevuto già in soluzione e utilizzato come indicato nei vari esperimenti. L’argento ionico utilizzato come controllo è sotto forma di AgNO3 disciolto in acqua bidistillata alla concentrazione di 20 μg/ml.
Ceppi Batterici e fungini utilizzati
I ceppi batterici utilizzati in questo studio sono i seguenti:
Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Shigella sonnei (ATCC25931), Escherichia coli (DH5a), Pseudomonas aeruginosa (PO1). Il ceppo fungino è Candida albicans (ATCC 10231).
Cellule umane utilizzate
HeLa (linea di adenocarcinoma della cervice uterina); HDF (Human Dermal Fibroblast).
Saggio di attività antibatterica su piastra
Aliquote di 100 µl dei diversi ceppi batterici in fase esponenziale di crescita sono stati mescolati con 10 ml di terreno di coltura LB e soft agar (0.7%). Sulle piastre sono stati fatti spot di 10 µl (200 ng) e 20 µl (400 ng) di argento colloidale o di argento ionico o ampicillina (25 ng). Le piastre sono state incubate ON a 37 °C.
Saggio di attività antibatterica in liquido
Sono stati condotti due tipi di saggi in liquido.
A) i ceppi batterici indicati sono stati cresciuti fino alla fase stazionaria, quindi diluiti e fatti crescere in presenza di diverse concentrazioni di argento colloidale (2 µg/ml, 4 µg/ml, 8 µg/ml, 10 µg/ml) e argento ionico come controllo (4 µg/ml, 6 µg/ml) per 16 ore. Per valutare la crescita batterica si sono misurate le densità ottiche a 600 nm mediante uno spettrofotometro.
B) i ceppi indicati sono stati cresciuti fino alla fase stazionaria, quindi diluiti e fatti crescere per due ore in presenza di due diverse concentrazioni di argento colloidale (2 µg/ml, 0.5 µg/ml). Al termine delle due ore le cellule sono state piastrate a diverse diluizioni in modo da calcolare il numero di cellule vitali in grado di formare colonie (CFU) in seguito al trattamento.
Saggio di tossicità su cellule umane
Sono stati condotti saggi MTT su cellule umane in coltura. Il saggio MTT, la cui sigla indica il composto bromuro di-3-(4,5- dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio, consente una valutazione colorimetrica dell’attività del metabolismo mitocondriale delle cellule trattate. In particolare, la succinato deidrogenasi, riduce l’MTT a formazano sviluppando un colore che diviene indice dell’attività mitocondriale e dunque della vitalità delle cellule.
Le cellule sono state piastrate e il giorno successivo è stato sostituito il terreno di coltura con mezzo fresco contenente argento colloidale o argento ionico a diverse concentrazioni. Dopo 24 ore è stato aspirato il terreno contenente l’argento e le cellule sono state trattate con la soluzione di MTT per 3 ore. Il risultato dell’esperimento è stato rilevato mediante lettura allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 570 nm.
RISULTATI
Saggi di attività antibatterica in piastra
Allo scopo di valutare l’attività antibatterica dell’Argento Colloidale nei confronti di diversi ceppi di batteri sia Gram + (Staphylococcus aureus, Lysteria monocytogenes) che Gram – (Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Shigella sonnei) sono stati allestiti saggi di attività antibatterica su piastra (vedi Materiali e Metodi). Come si può osservare in Figura 1, la presenza di argento colloidale, cosi come di argento ionico, sia alla quantità di 200 ng che di 400 ng determina inibizione della crescita batterica dei vari ceppi analizzati, incluso Lysteria monocytogenes per il quale si riscontra una minore sensibilità all'argento sia ionico che colloidale.
Saggi di attività antibatterica in liquido
Allo scopo di valutare in maniera più precisa l’azione dell’argento sui vari ceppi, abbiamo allestito due tipi di saggi di attività in liquido (vedi Materiali e Metodi).
A) in un primo tipo di saggio abbiamo valutato l’attività dell’argento colloidale a varie concentrazioni (2,4,8,10 µg/ml) durante 16 ore di incubazione ON a 37 °C.
Come si può osservare nella Figura 2, l’argento colloidale esercita un effetto dose dipendente su tutti i ceppi analizzati con un effetto di inibizione della crescita di circa il 40% alla concentrazione di argento colloidale di 2 µg/ml e dell’ 80-85% alla concentrazione di argento colloidale di 10 µg/ml. Anche in questo tipo di saggio si conferma l’insensibilità di Lysteria monocytogenes all’azione dell’argento.
B) abbiamo condotto un’analisi più approfondita per valutare se l’effetto esercitato dall’argento fosse di inibizione della crescita (effetto citostatico) oppure di induzione della morte cellulare (effetto citotossico). Abbiamo scelto di condurre l’analisi su un batterio Gram – rappresentativo (Escherichia coli) e su un batterio rappresentativo Gram + (Staphylococcus aureus) e abbiamo introdotto un microrganismo eucariotico (Candida albicans) nell’analisi. Le crescite sono state condotte per solo due ore (vedi Materiali e Metodi) in presenza di quantità molto più basse di argento colloidale (0.5 μg/ml e 2 g/ml) e la valutazione dell’effetto è stata condotta mediante piastratura e conta vitale. Come si può osservare in Figura 3, l’applicazione di argento colloidale esercita un notevole effetto citotossico sia alla concentrazione di 2 μg/ml (75-90% di mortalità) che alla concentrazione ancora più bassa di 0.5 μg/ml (50-70% di mortalità) sia su Escherichia coli che su Candida albicans. Viceversa l’effetto è praticamente inesistente su Staphylococcus aureus, indicando un effetto meno marcato dell’argento sui batteri Gram + (vedi anche Figura 2 e dati non mostrati).
Queste analisi, nel loro insieme, suggeriscono che l’argento colloidale esercita un discreto effetto antibatterico/antifungino nelle condizioni da noi osservate, con un effetto prevalente sui batteri Gram-. I nostri dati sembrano inoltre suggerire che l’effetto sia di tipo soprattutto citotossico dal momento che osserviamo una notevole mortalità a due ore dal trattamento con basse concentrazioni di argento (0.5 e 2 μg/ml).
Figura 2. Saggio di attività antibatterica in liquido: (A) La figura mostra la percentuale di inibizione della crescita batterica condotta per 16 ore a 37°C in presenza di diverse concentrazioni di argento colloidale (barre in blu) e argento ionico (barre in grigio). Il metodo utilizzato è stato quello della lettura spettrofotometrica.
Saggi di tossicità su cellule umane
Abbiamo valutato l’eventuale tossicità dell’argento colloidale su diversi tipi di cellule umane in coltura (vedi Materiali e Metodi).
A tale scopo abbiamo deciso di utilizzare il saggio MTT, un test di vitalità cellulare, che permette di quantificare l’attività di un enzima mitocondriale che funziona solo nelle cellule vive. Pertanto, nelle cellule con un metabolismo basso, quindi con una vitalità limitata, l’MTT viene ridotto molto poco; al contrario, le cellule in rapida divisione mostrano alti tassi di riduzione di MTT.
Come si può osservare in Figura 4, il trattamento con argento colloidale alla concentrazione di 2 μg/ml non determina effetti tossici sia su cellule tumorali della cervice uterina (HeLa) che su cheratinociti immortalizzati (HaCat) e fibroblasti dermali normali (HDF). A concentrazioni più elevate (4 μg/ml) si ha un lieve effetto tossico con una riduzione della vitalità cellulare. E’ importante osservare che l’argento ionico utilizzato come controllo positivo, al contrario, esercita un notevole effetto tossico, determinando un drastica diminuzione della vitalità delle cellule. Gli stessi esperimenti sono stati effettuati anche su cellule Caco-2 (adenocarcinoma di colon) fornendo simili risultati (dati non mostrati).
REFERENZE
- Chopra I. “The increasing use of silver-based products as antimicrobial agents: a useful development or a cause for concern?” Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2007) 59, 587–590 doi:10.1093/jac/dkm006
- Landsdown AB, Williams A., “Bacterial resistance to silver in wound care and medical devices”. J Wound Care (2007) Jan;16(1):15-9.
- Morgun A, Dzutsev A, Dong X, Greer RL, Sexton DJ, Ravel J, Schuster M, Hsiao W, Matzinger P, Shulzhenko N. “Uncovering effects of antibiotics on the host and microbiota using transkingdom gene networks.” Gut. 2015 Nov;64(11):1732-43. doi: 10.1136/gutjnl-2014-308820. Epub 2015 Jan 22.
Napoli, 18 Aprile 2016
Prof. Alessandra Pollice
Prof. Ezio Ricca Direttore Dipartimento di Biologia
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a cura di Gino Riccardo Navarra → leggi la biografia